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實驗室儀器
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蛋白質酶的提取
[2013/10/23]
大部分蛋白質都可溶于水、稀鹽、稀酸或堿溶液,少數(shù)與脂類結合的蛋白質則溶于乙醇、丙酮、丁醇等有機溶劑中,因些,可采用不同溶劑提取分離和純化蛋白質及酶。
1.有機溶劑提取法
一些和脂質結合比較牢固或分子中非極性側鏈較多的蛋白質和酶,不溶于水、稀鹽溶液、稀酸或稀堿中,可用乙醇、丙酮和丁醇等有機溶劑,它們具的一定的親水性,還有較強的親脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必須在低溫下操作。丁醇提取法對提取一些與脂質結合緊密的蛋白質和酶特別優(yōu)越,一是因為丁醇親脂性強,特別是溶解磷脂的能力強;二是丁醇兼具親水性,在溶解度范圍內(度為10%,40度為6.6%)不會引起酶的變性失活。另外,丁醇提取法的pH及溫度選擇范圍較廣,也適用于動植物及微生物材料。
2.水溶液提取法
稀鹽和緩沖系統(tǒng)的水溶液對蛋白質穩(wěn)定性好、溶解度大、是提取蛋白質最常用的溶劑,通常用量是原材料體積的1-5倍,提取時需要均勻的攪拌,以利于蛋白質的溶解。提取的溫度要視有效成份性質而定。一方面,多數(shù)蛋白質的溶解度隨著溫度的升高而增大,因此,溫度高利于溶解,縮短提取時間。但另一方面,溫度升高會使蛋白質變性失活,因此,基于這一點考慮提取蛋白質和酶時一般采用低溫(5度以下)操作。為了避免蛋白質提以過程中的降解,可加入蛋白水解酶抑制劑(如二異丙基氟磷酸,碘乙酸等)。
提取液的pH值和鹽濃度的選擇:
1.pH值
蛋白質酶是具有等電點的兩性電解質,提取液的pH值應選擇在偏離等電點兩側的pH 范圍內。用稀酸或稀堿提取時,應防止過酸或過堿而引起蛋白質可解離基團發(fā)生變化,從而導致蛋白質構象的不可逆變化,一般來說,堿性蛋白質用偏酸性的提取液提取,而酸性蛋白質用偏堿性的提取液。
2.鹽濃度
稀濃度可促進蛋白質的溶,稱為鹽溶作用。同時稀鹽溶液因鹽離子與蛋白質部分結合,具有保護蛋白質不易變性的優(yōu)點,因此在提取液中加入少量NaCl等中性鹽,一般以0.15摩爾。升濃度為宜。緩沖液常采用0.02-0.05M磷酸鹽和碳酸鹽等滲鹽溶液。