利用各種化學(xué)物質(zhì)所具有的發(fā)射、吸收或散射光譜譜系的特征，來(lái)確定其性質(zhì)、結(jié)構(gòu)或含量的技術(shù)，稱為光譜分析技術(shù)。根據(jù)光譜譜系的特征不同，可把光譜分析技術(shù)分為發(fā)射光譜分析、吸收光譜分析和散射光譜分析三大類(lèi)。在臨床生物化學(xué)檢驗(yàn)中，光譜分析是一類(lèi)十分重要的技術(shù)，應(yīng)用極為廣泛。

　　I.光譜分析法(photometry)

　　1.定義：根據(jù)物質(zhì)吸收、發(fā)射或散射輻射能而建立起來(lái)的一類(lèi)分析方法。

　　2.光的基本性質(zhì)：高速傳播的電磁輻射;

　　具有波動(dòng)性(l=c/v)和微粒性(E=hv);短波能量大，長(zhǎng)波能量小

　　3.物質(zhì)對(duì)光吸收的基本原理：

　　能量轉(zhuǎn)移----當(dāng)光輻射通過(guò)某種物質(zhì)時(shí)，組成該物質(zhì)的分子與光子發(fā)生“碰撞”，光子的能量就轉(zhuǎn)移至分子、原子上，使它們由基態(tài)(低能態(tài))躍遷到激發(fā)態(tài)(高能態(tài))，這種躍遷稱為激發(fā)。

　　選擇吸收----組成物質(zhì)的分子僅吸收與其內(nèi)能變化(基態(tài)與激發(fā)態(tài)能量差)相對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)或頻率的光，所得到的光譜稱為吸收光譜。

　　能量釋放----處于較高能態(tài)的分子(激發(fā)態(tài)分子)不穩(wěn)定，當(dāng)其返回基態(tài)時(shí)，以熱或發(fā)射光譜的形式將能量釋放出來(lái)。所發(fā)射出的相應(yīng)光譜，稱分子發(fā)射光譜。

　　4.分類(lèi)

　　(1)吸收光譜分析法：根據(jù)溶液能吸收由光源發(fā)出的某些波長(zhǎng)的光后所形成的特征光譜來(lái)鑒定該物質(zhì)的性質(zhì)和含量的方法。

　　(可見(jiàn)、紫外分光光度法(visibleandultravioletspectrophotometry)原子吸收光譜法(atomicabsorptionspectrophotometry)：微量金屬元素紅外分光光度法)

　　(2)發(fā)射光譜分析法：根據(jù)物質(zhì)受到熱能或電能等的激發(fā)后所發(fā)射出的特征光譜來(lái)進(jìn)行定性及定量分析的一種方法。

　　(火焰發(fā)射光譜法(flameemissionphotometry)：堿金屬/堿土金屬元素?zé)晒夤庾V法(fluorometry)：少量無(wú)機(jī)物、酶活力、激素等)

　　(3)比濁/散射光譜分析法：測(cè)定光線通過(guò)溶液混懸顆粒后的光吸收或光散射程度的一類(lèi)定量方法。

　　比濁法(turbidimetry)：在光源的光路方向上測(cè)定透射光強(qiáng)度(透射光&散射光)與入射光強(qiáng)度的比值和膠體溶液中質(zhì)點(diǎn)濃度間的關(guān)系。

　　散射測(cè)濁法(nephelometry)：在光路的垂直方向上測(cè)量散射光強(qiáng)度和膠體溶液中質(zhì)點(diǎn)間的關(guān)系。

　　5.特點(diǎn)：靈敏度高;測(cè)定簡(jiǎn)便、快速;試樣不被破壞等。

　　II.可見(jiàn)、紫外分光光度法

　　1.定義：根據(jù)物質(zhì)分子對(duì)于200nm~700nm光區(qū)電磁輻射的吸收特性進(jìn)行分析的方法。

　　可見(jiàn)光：400~700nm,有色物質(zhì)溶液

　　紫外光：200~400nm,無(wú)色物質(zhì)

　　2.特點(diǎn)：靈敏度高(10-4~10-7g/ml);選擇性強(qiáng);精確度和準(zhǔn)確度高;儀器設(shè)備簡(jiǎn)單，操作易掌握

　　3.吸收光譜

　　(1)光譜的產(chǎn)生：化合物分子的價(jià)電子躍遷

　　(2)吸收光譜曲線：電子躍遷的吸收波長(zhǎng)和吸收強(qiáng)度可用儀器測(cè)定，在可見(jiàn)、紫外光區(qū)內(nèi)繪制或掃描得到一條以波長(zhǎng)(l)為橫坐標(biāo),吸光度(A)為縱坐標(biāo)的吸收曲線。

　　4.光吸收的基本定律(Lamber-Beer’sLaw)

　　(1)定律：?jiǎn)紊�光通過(guò)吸光溶液后，吸光度與濃度或厚度之間呈正比關(guān)系。

　　Lamber定律：說(shuō)明吸收與厚度間的關(guān)系

　　Beer定律：說(shuō)明吸收與濃度間的關(guān)系

　　(2)表達(dá)式：

　　*a為吸光系數(shù)(absorptivity),即吸光物質(zhì)在單位濃度及單位厚度時(shí)的吸光度。

　　b為液層厚度

　　c為溶液濃度(concentration)

　　5.比色法(colorimetry)

　　(1)定義：用可見(jiàn)光作光源，比較溶液的顏色深淺度以測(cè)定所含有色物質(zhì)濃度的方法

　　(2)所用儀器：分光光度計(jì)(spectrophotometer)

　　(i)基本原理：溶液中的物質(zhì)在光的照射激發(fā)下，產(chǎn)生了對(duì)光吸收的效應(yīng)，物質(zhì)對(duì)光的吸收是具有選擇性的。各種不同的物質(zhì)都具有其各自的吸收光譜，故當(dāng)某單色光通過(guò)溶液時(shí)，其能量就會(huì)被吸收而減弱，光能量減弱的程度和物質(zhì)的濃度有一定的比例關(guān)系。

　　(ii)結(jié)構(gòu)組成(以722分光光度計(jì)為例)

　　光源：可見(jiàn)光區(qū)的光源為鎢燈，波長(zhǎng)范圍是320~1000nm。

　　(紫外光區(qū)的光源為氫燈或氘燈，波長(zhǎng)是200~320nm)

　　單色器：一種將光源產(chǎn)生的混合光分解為單一波長(zhǎng)的光學(xué)系統(tǒng)。一般是根據(jù)通過(guò)棱鏡的折射或光柵的衍射而獲得的。

　　試樣室：由比色皿座架及光門(mén)組成。可見(jiàn)光區(qū)用光學(xué)玻璃比色皿(紫外光區(qū)用石英比色皿)

　　光電管暗盒：由光電管(可將光能轉(zhuǎn)變?yōu)榭梢苑糯髾z測(cè)和記錄的電能)和微電流放大器組成。

　　顯示器：由放大器和讀數(shù)元件組成。

　　(3)比色法的定量方法：

　　(i)標(biāo)準(zhǔn)曲線法：將一系列濃度不同的標(biāo)準(zhǔn)溶液按照一定操作過(guò)程顯色后，分別測(cè)吸光度(A)，以A為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)制標(biāo)準(zhǔn)曲線(至少要5點(diǎn))。在相同條件下處理待測(cè)物質(zhì)并測(cè)定其吸光度，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線找出相對(duì)應(yīng)的濃度。

　　(ii)對(duì)比法：將標(biāo)準(zhǔn)品與待測(cè)樣品在相同條件下顯色并測(cè)定各自的吸光度。由于測(cè)定體系溫度、厚度及入射光波長(zhǎng)一致，故標(biāo)準(zhǔn)與待測(cè)樣品a&b值相等，可用下式比較計(jì)算待測(cè)樣品濃度Cx=Cs´As/Ax。